枯叶龟在年龄还比较小的时候，基本是没办法区分雌雄的，尤其是刚出生的枯叶龟，是无法区分雌雄的。区分雌雄需要在性腺开始发育之后进行，或者等到雄枯叶龟和雌枯叶龟在外观上的区别特征变得明显之后才能区分。一般情况下，人工养殖的枯叶龟，需要养殖2-3年才能够比较明确地区分雌雄。
雌枯叶龟的体长通常要较雄枯叶龟大一些，与其他的成年龟一样，雄枯叶龟有着较雌枯叶龟长和宽的尾巴。还可以在枯叶龟发育后将枯叶龟的腹甲朝上，左手的大拇指、食指二中指分别将枯叶龟的前肢、头压迫缩入壳内，右手将枯叶龟的尾摆直，若枯叶龟的泄殖腔孔内有黑色的阴茎伸出，则为雄枯叶龟，若枯叶龟的泄殖腔孔排出泡泡或稀粘液，则为雌枯叶龟。
